歐盟內(nèi)分泌干擾評估進(jìn)展激進(jìn)：內(nèi)分泌干擾物的識別是當(dāng)前全球化學(xué)品安全性評估中關(guān)注的重點,尤其是歐盟在2018年針對農(nóng)藥與消殺產(chǎn)品的內(nèi)分泌干擾物評審正式啟動后,已有多個活性物質(zhì)(如代森錳鋅等)因為內(nèi)分泌干擾效應(yīng)無法被排除而被歐盟禁用。同時隨著CLP修正案(Regulation (EC) No 1272/2008)的進(jìn)一步實施,歐盟也已將內(nèi)分泌干擾物的識別要求進(jìn)一步拓展到了一般化學(xué)品。

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美國內(nèi)分泌干擾物識別進(jìn)展緩慢

雖然美國環(huán)境保護署(US EPA)早在1998年就推動基于兩階段的體外和體內(nèi)試驗內(nèi)分泌干擾物識別項目(EDSP),但在實際法規(guī)應(yīng)用和實施方面美國則顯著落后于歐盟。

而EDSP難以推進(jìn)的主要原因在于：花費巨大。

據(jù)統(tǒng)計每個化學(xué)品僅完成第一階段的試驗內(nèi)容預(yù)計花費就高達(dá)百萬美元,而其中絕大部分費用的支出都集中在體內(nèi)試驗項目中。

EDSP兩階段的內(nèi)分泌干擾物識別試驗指南：

(圖片源自：US EPA)

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新途徑技術(shù)方法(NAMs)首次明確可用于內(nèi)分泌干擾物識別

因此US EPA在十幾年間都聚焦于體外高通量篩選、in silico等新途徑技術(shù)方法(NAMs)的研發(fā),建立了相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫和計算模型來嘗試替代之前EDSP第一階段所需要的高昂試驗資料。

但為了滿足法規(guī)應(yīng)用目的,這些NAMs能否直接用于第一階段的內(nèi)分泌干擾活性評估必須得到充分的確認(rèn),US EPA在系統(tǒng)衡量了穩(wěn)健性(strengths)、局限性(limitation)和不確定性(uncertainties)后最終明確了兩種NAMs可以用于替代EDSP第一階段雌激素和雄激素受體信號通路所需的試驗資料。

兩種可用于替代EDSP第一階段試驗的NAMs：

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NAMs的成功應(yīng)用依賴于海量數(shù)據(jù)獲取與可靠模型開發(fā)

這兩種經(jīng)充分評估的NAMs成功應(yīng)用均得益于前期由US EPA等機構(gòu)主導(dǎo)進(jìn)行的ToxCast/Tox21項目,ToxCast/Tox21項目依托于細(xì)胞體外高通量篩選,采用機械臂進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和靶點檢測,其中涉及內(nèi)分泌干擾相關(guān)靶點的檢測納入了數(shù)十種細(xì)胞系,并能對數(shù)千種化合物進(jìn)行高通量檢測,因而此項目的結(jié)果是產(chǎn)生了一個極大的數(shù)據(jù)集。

Tox21項目中所采用機械臂進(jìn)行細(xì)胞操作

(來源：https://tox21.gov/overview/)

為了利用這些數(shù)據(jù)集來滿足EDSP的替代傳統(tǒng)體內(nèi)動物試驗的需求,ToxCast/Tox21項目又進(jìn)一步向數(shù)據(jù)科學(xué)家開放了數(shù)據(jù)集,來利用這些已產(chǎn)生的大數(shù)據(jù)開發(fā)具有高預(yù)測可靠性的模型,由此兩種能滿足法規(guī)評估要求的內(nèi)分泌干擾NAMs最終被成功開發(fā)。

基于網(wǎng)絡(luò)模型對體外雌激素受體信號通路建模分析

(來源：TOXICOLOGICAL SCIENCES, 148(1), 2015, 137–154)

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證據(jù)權(quán)重(WoE)仍是內(nèi)分泌干擾評估的關(guān)鍵

本次US EPA除了明確NAMs可以用于內(nèi)分泌干擾物篩選,也在配套發(fā)布的白皮書中再次強調(diào)了需要通過證據(jù)權(quán)重(WoE)的方式來整合內(nèi)分泌干擾評估過程中涉及的所有相關(guān)數(shù)據(jù),這既包括了已經(jīng)明確的NAMs以及滿足GLP要求的動物體內(nèi)數(shù)據(jù),也應(yīng)匯總其他試驗結(jié)果(如未經(jīng)明確的NAMs)、(Q)SAR預(yù)測、藥代/毒代動力學(xué)等各種數(shù)據(jù),進(jìn)而毒理學(xué)家能在全面收集和充分評估的基礎(chǔ)上采用WoE的方式進(jìn)行整合分析,來得出可靠的內(nèi)分泌干擾物篩選結(jié)果。

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多數(shù)農(nóng)藥品種將受益于NAMs的法規(guī)應(yīng)用

值得注意的是,由于農(nóng)藥的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)一直被廣泛關(guān)注,因此在ToxCast/Tox21以及EDSP等項目立項之初就已涵蓋了多數(shù)農(nóng)藥品種,對于這些農(nóng)藥可以優(yōu)先考慮采用這兩種NAMs來滿足法規(guī)登記所需的對雌激素和雄激素受體信號通路相關(guān)試驗資料,因此將大大降低農(nóng)藥申請人在應(yīng)對美國內(nèi)分泌干擾評估的周期與費用。

新途徑技術(shù)方法(New Approach Methods, NAMs)

為應(yīng)對實驗技術(shù)的轉(zhuǎn)變,美國環(huán)境保護署(US EPA)也提出了一個新概念：新途徑技術(shù)方法(New Approach Methods, NAMs),該術(shù)語的定義泛指″能夠提供化學(xué)物質(zhì)危害評估和風(fēng)險評估信息,且有別于傳統(tǒng)動物實驗,更符合3R原則的測試技術(shù)方法與它們的組合″。

所以作為一個符合動物福利的新概念,NAMs幾乎囊括了絕大多數(shù)的動物實驗替代技術(shù),如虛擬篩選(virtual screening)、(Q)SAR、交叉參照(read-across)、體外細(xì)胞實驗、器官芯片(Organs-on-a-Chip, OOC)、有害結(jié)局路徑(Adverse Outcome Pathway, AOP)、確定性方法(Defined Approach)、整合測試與評估方法(Integrated Approaches to Testing and Assessment, IATA)等。

這些技術(shù)與方法的發(fā)展將實質(zhì)性地促進(jìn)動物實驗替代。